Gram Boyama Tekniği
1884 yılında Danimarkalı bilim insanı Hans Christian Gram tarafından, pnömokoklar (Streptococcus pneumoniae) ile Klebsiella pneumoniae bakterilerini ayırt etmek için bulunmuş, geliştirilmiş ve günümüz mikrobiyoloji laboratuvarlarında sıkça kullanılan bir tekniktir. Gram boyama tekniği; bakterileri, hücre duvarlarının fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre iki ana gruba (Gram pozitif (Gram (+)) ve Gram negatif (Gram (-)) ayırmak için kullanılan empirik (Deneycilik, empirizm veya ampirizm, bilginin duyumlar sayesinde ve deneyimle kazanılabileceğini öne süren görüş.) bir yöntemdir. Basillerin yaklaşık yarısı, kokların (yuvarlak bakterilerin) büyük kısmı ve mantarlar gram (+) özellik gösterirken,spiral şekilli bakterilerin tamamı gram (-) özellik taşırlar.
Gram boyama tekniği, bakteriyoloji laboratuvarlarında bir bakteri örneğinin kimliğinin belirlenmesin de ilk adım olan Gram (+)/Gram (-) ayrımının yapılmasında kullanılabildiği gibi tıbbî alanlarda da kullanılabilir. Tıbbî alanda gram boyama tekniği birkaç farklı şekilde görülebilir. Bunlardan bazıları;
- Enfeksiyon şüphesi olan vücut sıvılarında ve biyopsi örneklerinde gram boyama tekniğinin kullanılması.
- Menenjit şüphesi olan beyin omurilik sıvısı örneklerinde veya septik artrit (Eklemlerde enfeksiyon sonucu oluşan ve şiddetli ağrıya yol açan durum) şüphesi olan durumlarda eklem sıvılarında kullanılabilir.
- Bazen günlerce beklemeye sebep olan kültür uygulamalarında çabuk sonuç alınması için gram boyama tekniği kullanılır.
Gram boyama için hazırlanacak perepatlarda kullanılacak kültürlerin genç (18-24 saatlik) olması gram boyama tekniğinin olumlu sonuçlanması için önemlidir.
En sık uygulanan gram boyama yöntemindeki işlemler sırayla şöyledir;
- Sıvı ve katı kültür ortamından öze alınıp perpat (lam) üzerine yayılan bakteri kültürünün havada kuruması sağlanır.
- Perepat 3 defa alevden geçirilerek fiziksel tespit yapılır.
- Perepat boya kabına konarak, kristal viyole ile 1 dakika boyanır. Bu sırada gram (+) ve gram (-) mikroorganizmaların tamamı kristal viyole boyası ile mor renge boyanırlar.
- Perepat bol distile su ile yıkanır.
- Perepat üzerinde kalan boya üzerine lugol ilavesi yapılır ve 1 dakika beklenir. Perepatlara eklenen lugol solüsyon ile gram (+) mikroorganizmaların oluşturdukları yapı, daha sonra ortama eklenen alkol ile giderilmez. Oysa gram (-) mikroorganizmaların oluşturduğu yapı alkol ile giderilebilir. Bir başka deyişle, boya, mikroorganizmanın hücresinden dışarıya atılır (dekolarizasyon).
- Perepat distile su ile yıkanır.
- Perepatın üzerine %95'lik etanol alkol veya asit-alkol karışımı eklenerek 10-15 saniye beklenir.
- Perepat distile su ile yıkanır.
- Perepatın üzerine sulu fuksin veya safarin boya çözeltisi dökülerek 30 saniye beklenir. Gram (-) mikroorganizmaların renkleri alkolle gittiğinden ortama daha sonra eklenen safarin veya sulu fuksin ile boyanır. Böylece gram (+) mikroorganizmalar mor renkte (kristal viyole rengi), gram (-) mikroorganizmalar ise pembe renkte (safarinden veya sulu fuksinden ötürü) boyanır.
- Perepat bol distile su ile yıkanır.
- Perepat kurutma kağıdıyla kurutulur.
- Bir damla immersiyon yağı damlatılarak mikroskopta inceleme yapılır.
- Objektif sahasında görülen mor renkli mikroorganizmalar gram (+), pembe renkte olan mikroorganizmalar ise gram (-) olarak değerlendirilir.
Gram boyama özelliği mikroorganizma hücre duvarının (çeperinin) yapısı ile ilişki içerisindedir. Hücre duvar yapıları arasındaki farklar;
- Gram (+) mikroorganizmaların hücre çeperinde, gram (-) mikroorganizmalara kıyasla oldukça kalın peptidoglikan tabaka mevcuttur. Bu nedenle aldıkları boyayı alkolle dekolarizasyonda gram (-) mikroorganizmalara nazaran daha geç bırakırlar.
- Gram (+) mikroorganizmaların hücre çeperinde karbonhidratlar, gram (-) mikroorganizmaların hücre çeperinde ise lipitler fazladır. Karbonhidratlar alkolle dekolarizasyon esnasında dehidratasyona (su molekülü açığa çıkması) uğrar. Porlar iyice büzüşür, daralır ve boya dışarı çıkamaz. Lipitlerde ise alkol çözücüdür ve hücre çeperinde olan porlar daha çok açılarak genişler.
- Gram (+) mikroorganizmaların hücre çeperinde teikolik asit olmasına rağmen gram (-) mikroorganizmaların hücre çeperinde teikolik asit yoktur.
- Gram (+) bakterilerin pH'ı, gram (-) bakterilere göre daha asidiktir.
Gram Boyama Tekniğinin Avantajları
- Mikroorganizmalar gram (+) ve gram (-) olmak üzere ikiye ayrılır.
- Mikroorganizmaların morfolojisi ve dizilimi esas olarak ön tanı konur. Buna dayanarak nispeten uygun bir antibiyotik seçilir, izolasyon için uygun besi yeri seçimi yapılır.
- Anaerop mikroorganizma olup olmadığı hakkında bilgi verir.
- http://www.wikizero.info/
- http://www.megep.meb.gov.tr/?page=moduller (Boyama Yöntemleri)
- https://www.tech-worm.com/gram-boyama-nedir-ne-ise-yarar-nasil-yapilir/
- http://www.biyologlar.com/gram-boyama
Yazar: Selçuk Dikici
